Direvisi pada 19 Februari 2018
- JUDUL PRAKTIKUM
Penetapan [Kafein] Dengan HPLC
- TUJUAN PERCOBAAN
1. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif.
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoprasian HPLC.
3. Dapat menghitung [Kafein] dalam sampel.
- PRINSIP PERCOBAAN
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, disaring dengan kertas saring khusus, filtrat diinjeksikan ke dalam kolom kemudian terbawa oleh fasa geraknya dan ditangkap oleh detektor 52500 dengan λ 273 nm dengan sistem gerak isokratik. Hasil analisa menampilkan konsentrasi dalam satuan ppm dibandingkan terhadap standarnya dilihat dari waktu retensi dan luas area puncak kromatogram.
- DASAR TEORI
Kafein
Kafeina, atau lebih populernya kafein, ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perangsang psikoaktif dan diuretik ringan. Kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan Jerman, Friedrich Ferdinand Runge, pada tahun 1819. Ia menciptakan istilah "kaffein" untuk merujuk pada senyawa kimia pada kopi. Kafeina juga disebut guaranina ketika ditemukan pada guarana, mateina ketika ditemukan padamate, dan teina ketika ditemukan pada teh. Semua istilah tersebut sama-sama merujuk pada senyawa kimia yang sama.
Rumus kimia untuk kafein yaitu C8H10N4O2, kafein murni berbentuk kristal panjang, berwarna putih, tidak berbau dan rasanya pahit. Didalam biji kopi kafein berfungsi sebagai unsur rasa dan aroma. Kafein murni memiliki berat molekul 194.19 gr, titik leleh 236°C dan titik didih 178°C (Aisyah, 2013).
Kafeina dijumpai pada banyak spesiestumbuhan, di mana ia berperan sebagai pestisidaalami. Dilaporkan bahwa kadar kafeina yang tinggi dijumpai pada semaian yang baru tumbuh. Kafeina melumpuhkan dan mematikanserangga-serangga tertentu yang memakan tanaman tersebut. Kadar kafeina yang tinggi juga ditemukan pada tanah disekitar semai biji kopi. Diketahui bahwa ia berperan sebagai penghambat perkecambahan semai kopi lain di sekitarnya, sehingga meningkatkan tingkat keberlangsungan hidup kecambah kopi itu sendiri.
HPLC
HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif.
Instrumentasi HPLC
• Fase gerak (eluen)
berupa zat cair yang biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur, secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan solut-solut.
• Pompa
dianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui kolom. Syarat pompa yang digunakan adalah : harus inert terhadap fase gerak.Bahan yang umumnya dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.
Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan
• Injektor
merupakan tempat masuknya sampel. Sampel yang dimasukkan ke dalam HPLC hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor merupakan suatu sistem autosampler).
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan kepembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT
• Kolom HPLC
berisi fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Biasanya berukuran antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar antara 4-10 mm. Jenis kolom bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Yang paling banyak dipakai adalah kolom C-8 dan C-18. Saat ini yang baru diperkenalkan adalah kolom HILIC (Hidrophilic Interactive Liquid Chromatography).
• Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
- ALAT & BAHAN
Alat :
• Alat HPLC
• Injector HPLC
• Botol Timbang
• Kaca arloji
• Corong pendek
• Batang pengaduk
• Gelas kimia 100 mL
• Neraca analitik
• Kertas saring khusus
Bahan :
• Methanol
• Aqua DM
• Sampel kafein
- SINGKATAN PROSEDUR
A Persiapan Kolom HPLC
1. Disiapkan fasa gerak air:methanol (3:1)
2. Difurging dan dilanjutkan dengan mengalirkan fsa gerak pada kolom HPLC.
3. Dibuat metode pengukuran HPLC dengan λ 273 nm, laju alir 1,5 ml/menit.
B Persiapan Larutan Standar Kafein
1. Disiapkan fasa gerak air:methanol (3:1) tampung dalam botol fasa gerak.
1. Disiapkan fasa gerak air:methanol (3:1) tampung dalam botol fasa gerak.
2. Dilakukan furging terhadap kolom HPLC.
3. Dibuat larutan standar induk kafein 1000 ppm dalam labu ukur 25 ml.
4. Dibuat larutan standar kafein 40 ppm dalam labu ukur 25 ml dari standar induk 1000 ppm.
C Persiapan Sampel
1. Sampel kafein dalam labu 100 ml, disaring menggunakan kertas saring khusus.
1. Sampel kafein dalam labu 100 ml, disaring menggunakan kertas saring khusus.
2. Sampel siap diinjeksikan. (Copyright © SMKN13 Bandung)
- DATA PENGAMATAN
- PEMBAHASAN
1. Mode operasional yang digunakan pada praktikum kali ini adalah mode isokratik dimana komposisi fasa gerak dan laju kolom dibuat tetap sebesar 1,5 mL/menit.
2. Pelarut yang digunakan dikombinasikan komposisinya bertujuan untuk memberikan faktor kapasitas yang cocok sehingga faktor human error dapat dihindarkan.
3. Fase gerak yang digunakan sudah memenuhi persyaratan fasa gerak HPLC yaitu: jernih, murah, mudah diperoleh, dan tidak kental.
4. Proses degassing dilakukan untuk menghomogenkan dan menghilangkan gelembung-gelembung gas pada larutan induk. Karena dengan adanya gas dalam larutan sampel dapat menghambat pergerakan eluen sehingga terganggunya pemisahan pada kolom karena larutan sampel tidak merata dan akan menyebabkan terjadinya pelebaran puncak kromatogram. Selain itu, penghilangan gas ini juga diperlukan untuk menghindari noise pada detektor terutama fase organik berair.
5. Pembuatan larutan standar tersebut dilakukan secara kuantitatif. Oleh karena itu, penimbangan larutan baku kafein harus tepat, pemipetan larutan induk harus tepat, pengenceran larutan baku menjadi larutan standar harus pas sampai tanda batas. Pembuatan masing – masing konsentrasi dan pelabelan harus dilakukan secara teliti untuk mencegah terjadinya kekeliruan.
6. Pengenceran filtrat dengan aquabides dimaksudkan untuk membuat konsentrasi lebih kecil lagi dan mudah di analisis karena masih berada di dalam range kurva kalibrasi larutan standar. untuk membebaskan larutan sampel dari kotoran partikulat maka larutan standar tersebut disaring dengan selulosa nitrat dan dihomogenkan dengan ultrasonik vibrator. Digunakan membran selulosa nitrat untuk menyaring karena komponen yang akan dipisahkan bersifat polar.
7. Alat HPLC diset sesuai dengan kebutuhan pengukuran yaitu dengan panjang gelombang 273 nm, laju alir 1,5 mL/menit.Pada saat memasukan larutan standar maupun larutan sampel tidak terlalu banyak cukup dengan 20 mikoliter, karena jika terlalu banyak dapat menyebabkan band broadening (pelebaran peak) dan pada saat memasukan cuplikan pada syringe tidak ada gelembung udara agar menghasilkan pemisahan yang baik. Sebelum digunakan, syringe harus dibilas dengan mengunakan metanol agar terbebas dari kotoran.
8. Pada proses pemasukan cuplikan kedalam alat HPLC dilakukan dengan menggunakan alat injeksi syiringe. Syringe disuntikan melaui septum (seal karet), cuplikan yang masuk kemudian dialirkan oleh fasa gerak dengan bantuan pompa.
- KESIMPULAN
Dari praktikum kali ini untuk menganalisis kadar kafein dalam sampel menggunakan instrumen HPLC didapat kafein sebesar 39,35 ppm.
- DAFTAR PUSTAKA
• Mulja, M., Suharman. (1995). Analisis Instrumental. Surabaya: Airlangga University Press.
• Al-Anshory, Jamaludin. 2007. Diktat Pelatihan HPLC. Bandung : Universitas Padjadjaran
• Budiasih, Endang, dkk. 1999. Analisis Instrumentasi. Malang: Universitas Negeri Malang
• FARMASY-EFFENDY2.PDF
Semoga bermanfaat,
#Jika ada yang kurang jelas atau semacamnya silahkan komen saja di kolom komentar di bawah...
