Direvisi pada 15 Februari 2018
- JUDUL PRAKTIKUM
Penentuan [Paracetamol] dengan HPLC
- TUJUAN PERCOBAAN
-Dapat mengetahui prinsip kerja alat HPLC
-Dapat mengoperasikan alat HPLC dengan baik dan benar
-Dapat menentukan [Paracetamol] dengan metode HPLC
- PRINSIP PERCOBAAN
Sampel dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, disaring dengan kertas saring khusus, filtrat diinjeksikan ke dalam kolom kemudian terbawa oleh fasa geraknya dengan laju alir 1,5 mL/menit dan ditangkap oleh detector S2500 dengan panjang gelombang 243 nm dengan system gerak isokraktik. Hasil analisa menampilkan konsentrasi dalam satuan ppm dibandingkan terhadap standarnya dilihat dari waktu retensi 2,5 menit dan luas area puncak kromatogramnya
- DASAR TEORI
HPLC adalah sebuah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase gerak cair yang dialirkan melalui kolom yang merupakan fase diam menuju ke detektor dengan bantuan pompa. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak dengan cara penyuntikan.
Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa dalam kolom akan keluar atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi antara senyawa terhadap fase diam. Senyawa-senyawa yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar terlebih dahulu, dan sebaliknya senyawa yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan keluar lebih lama. Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Dari kromatogram tersebut akan dapat diidentifikasikan waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak. Informasi tR digunakan untuk analisis kualitatif, sedangkan informasi luas area atau tinggi puncak untuk analisis kuantitatif.
Instrumentasi HPLC
• Fase gerak (eluen)
berupa zat cair yang biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat bercampur, secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi, yang ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril.Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenos alkohol Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran menuju detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan solut-solut.
• Pompa
dianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui kolom. Syarat pompa yang digunakan adalah : harus inert terhadap fase gerak.Bahan yang umumnya dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit. Tujuannya adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat.
Ada 2 jenis pompa KCKT yaitu : pompa dengan tekanan konstan dan pompa aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tekanan konstan
• Injektor
merupakan tempat masuknya sampel. Sampel yang dimasukkan ke dalam HPLC hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor merupakan suatu sistem autosampler).
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung kedalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan meuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.Pada saat pengisian, sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan kepembuang. Pada saat penyuntikan katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikkan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1 %. Penyuntikkan ini mudah digunakan untuk otomatisasi dan sering digunakan untuk autosampler pada KCKT
• Kolom HPLC
berisi fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponennya. Biasanya berukuran antara 5-30 cm dan diameter dalam berkisar antara 4-10 mm. Jenis kolom bervariasi bergantung keperluan, misalnya dikenal kolom C-18, C-8, cyanopropyl, penukar ion. Yang paling banyak dipakai adalah kolom C-8 dan C-18. Saat ini yang baru diperkenalkan adalah kolom HILIC (Hidrophilic Interactive Liquid Chromatography).
• Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan dalam 2 golongan yaitu : detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektro spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti detektor UV-Vis, detektor Fluoresensi dan elektrokimia.
Parasetamol
Parasetamol (Asetaminofen) merupakan salah satu obat yang paling banyak digunakan sehari-hari. Obat ini berfungsi sebagai pereda nyeri dan penurun panas. Setelah puluhan tahun digunakan, parasetamol terbukti sebagai obat yang aman dan efektif. Tetapi, jika diminum dalam dosis berlebihan (overdosis), parasetamol dapat menimbulkan kematian.
Berbeda dengan obat analgesik yang lain seperti aspirin dan ibuprofen, parasetamol tak memiliki sifat antiradang. Jadi parasetamol tidak tergolong dalam obat jenis NSAID. Dalam dosis normal, parasetamol tidak menyakiti permukaan dalam perut atau mengganggu gumpalan darah, ginjal atau duktus arteriosus pada janin.
Parasetamol dapat dijumpai di dalam berbagai macam obat, baik sebagai bentuk tunggal atau berkombinasi dengan obat lain, seperti misalnya obat flu dan batuk. Antidotum overdosis parasetamol adalah N-asetilsistein (N-acetylcysteine, NAC). Antidotum ini efektif jika diberikan dalam 8 jam setelah mengkonsumsi parasetamol dalam jumlah besar. NAC juga dapat mencegah kerusakan hati jika diberikan lebih dini.
- ALAT & BAHAN
Alat :
• Alat HPLC
• Injector HPLC
• Botol Timbang
• Kaca arloji
• Corong pendek
• Batang pengaduk
• Gelas kimia 100 mL
• Neraca analitik
• Kertas saring khusus
Bahan :
• Methanol
• Aqua DM
• Sampel paracetamol
- SINGKATAN PROSEDUR
A. Persiapan kolom HPLC
1. Disiapkan fasa gerak air : methanol (3:1).
2. Furging dan lanjutkan dengan mengalirkan fasa gerak pada kolom HPLC.
3. Dibuat metode pengukuran HPLC dengan 243 nm, dengan laju alir 1,5 mL/menit.
B. Persiapan Larutan Standar Paracetamol
1. Disiapkan fasa gerak air : methanol (3:1), tampung dalam botol fasa gerak.
2. Dilakukan furging terhadap kolom HPLC.
3. Dibuat larutan induk standar Paracetamol 1000 ppm dalam labu ukur 25 mL.
4. Dibuat larutan standar Paracetamol 40 ppm dalam labu 25 mL, dari larutan induk standar 1000 ppm.
C. Persiapan Sampel
1. Dipipet 1 mL sampel, lalu diencerkan dalam labu ukur 100mL dengan pelarut air: methanol(3:1) labu A
2. Dipipet 2mL larutan dalam labu A dan diencerkan dlam labu ukur 25 mL.
3. Sampel paracetamol yang sudah siap, disaring menggunakan kertas saring khusus.
4. Sampel siap dinjeksikan.(Copyright © SMKN13 Bandung)
- DATA PENGAMATAN
- PEMBAHASAN
1. Komponen Utama alat HPLC ,yaitu :
- Reservoir
- Pump
- Detector
- Kolom
- Injector Port
- CBM & PCl.
2. Waktu Retensi adalah waktu interaksi zat yang akan dianalisis dan fasa diam dalam kolom sampai selesai dan dideteksi oleh detector.
3. Pengukuran endtime di PC dilebihkan dari waktu retensi agar peak yang terbentuk dihasilkan sepenuhnya . Jika endtime disamakan dengan waktu retensi , peak yang terbentuk tidak sepenuhnya.
4. Pada pengukuran HPLC perlu dilakukan Furging (Purge) untuk menghilangkan gelembung agar tidak ada gelembung pada kolom yang akan mengganggu proses pemisahan di kolom.
5. Furging dilakukan ketika akan memindahkan filter dan suatu wadah ke wadah yang lain,atau ketika setelah mengisi wadah. Ketika proses furging , pump dalam keadaan terbuka namun tanpa tekanan. Agar gelembung yang ada akan langsung terbawa ke penampung. Jika pump tertutup gelembung yang ada akan mengalir ke kolom yang nantinya akan mengganggu.
6. Larutan sampel dan standar harus disaring terlebih dahulu agar tidak ada padatan atau mineral yang sangat kecil yang dikhawatirkan dapat menyumbat pipa kapiler.
7. Dalam HPLC, kolom merupakan jantungnya HPLC yang diisi oleh senyawa non polar dalam hal ini adalah senyawa organic ,supaya senyawa polar dalam campuran akan melekat lebih lama pada silica polar.
8. Pemisahan komponen dengan HPLC ini dapat digunakan untuk proses secara kualitatif maupun kuntitatif. Pengukuran yang didasarkan secara kualitatif yaitu dengan ditunjukkan oleh waktu retensi.
9. Cara untuk mematikkan HPLC dapat dilakukan dengan diturunkan terlebih dahulu pompa tetapi mematikkannya jika detektor telah nol. Kolom harus tetap dalam keadaan dicuci dengan eluen, laju aliran diturunkan, setelah pompa menunjukkan angka nol maka pompa dimatikan, detektor dimatikan, setelah itu pastikan hubungan komputer dengan LC telah terputus, setelah itu matikan komputer dan terakhir adalah putuskan aliran listriknya..
- KESIMPULAN
Dari hasil Praktikum Penentuan [Paracetamol] dengan metode HPLC, didapat:
ᴥ Penentuan konsentrasi dilakukan pada lamda 243 nm, dengan laju alir 1,5 mL/menit
ᴥ Pada pengukuran dengan alat HPLC, didapat konsentrasi sampel = 29326,66 ppm
- DAFTAR PUSTAKA
· Jobsheet Kimia Instrumen 2014 rev
· Materi bahan ajar kimia instrumen
·http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/
Semoga bermanfaat,
 |
| Note: gambar hanya pemanis © created by artist |
#Jika ada yang kurang jelas atau semacamnya silahkan komen saja di kolom komentar di bawah...
